羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2, Hydroxyapatite, HA)是人体骨的主要无机成分, 临床上常用作骨骼创伤和缺损疾病的治疗[1]。除钙和磷之外, 人体骨矿物中含有的其他微量元素, 对骨骼发育起着重要作用[2,3,4]。其中, 铜(Cu)元素参与胶原的交联, 铜缺乏将降低骨骼力学性能[5,6]; 锌(Zn)是骨骼正常发育所必需的元素, 骨骼生长迟缓和骨质疏松症与锌缺乏有关[7,8]; 钴(Co)元素则可以以维生素B12和辅酶B12配合物的形式刺激造血功能, 影响骨生长[9]。此外, 铜、锌、钴元素均具有诱导血管生成和成骨细胞分化的能力, 可作为促进骨缺损愈合的补充剂[10,11,12]。硒(Se)是人体必需的微量元素, 可提高免疫系统的细胞增殖和抗体的合成水平, 从而提高机体免疫功能[13,14]。已有大量文献表明, 铁(Fe)、镁(Mg)、硅(Si)、锶(Sr)等其他微量元素对骨骼的发育和修复也有良好的促进作用[15,16,17,18,19,20]。因此研究合成元素离子掺杂HA可以模拟骨矿物的化学性质, 赋予合成HA更好的生物活性和特异治疗性能[21,22]。但前期研究只关注了一种或两种微量元素掺杂后HA的物相及生物学性能变化, 缺乏对这些元素掺杂特性的系统性研究。因此, 本研究将对微量元素的掺杂行为, 如进入HA晶格的趋势以及对HA晶体或粒子的物理化学特性影响等作深入探究。
水热合成是一种简易的元素掺杂HA制备方法, 具有成本低、易操作等优点。然而传统的水热合成需要高温高压环境, 存在水热烘箱内部温度不均匀、水热反应釜间温度分布不均匀、反应条件无法实现真实统一等缺点。因此, 本研究采用六位一体水热反应装置合成元素掺杂HA粒子。该装置含有六位可磁力搅拌100 mL反应器, 通过导热油加热或模块加热保证加热效率, 针式传感器实时监测反应温度, 实现温度精控, 从而确保各实验组反应条件一致。在此基础上可同时并行制备多种单一元素掺杂的HA粒子, 且为后续形貌及物相表征检测提供一致的实验条件基础。
本研究采用该方法制备了锌、硅、镁、铁、锰、锶、硒、钴、铜九种元素分别掺杂的HA陶瓷粉体材料, 并对这九种元素掺杂HA的行为作了系统探究, 包括材料表面形貌、物相组成、特征官能团及掺杂效率等方面的变化。
1 实验方法
1.1 材料制备
在六位一体水热反应装置(西安太康科技有限公司, PXF-(6))的聚四氟乙烯反应内胆中制备各组HA粉体材料样品。每个容器装入含有一种掺杂元素(表示为M; M=Zn、Mg、Fe、Mn、Sr、Co、Cu、Se、Si)的反应溶液。使用硝酸锌(Zn(NO3)2)、硝酸镁(Mg(NO3)2)、硝酸铁(Fe(NO3)2)、氯化锰(MnCl2)、硝酸铜(Cu(NO3)2)、硝酸锶(Sr(NO3)2)、硝酸钴(Co(NO3)2)作为掺杂元素源, 硅酸钠(Na2SiO3)和亚硒酸钠(Na2SeO3)作为硅、硒掺杂剂。将0.1 mol/L的硝酸钙溶液(Ca(NO3)2)和掺杂源溶液, 按照M/(Ca+M)(对于Zn、Mg、Fe、Mn、Sr、Co、Cu)和M/(P+M)(对于Si、Se)摩尔比为1%、3%或5%的比例混合, 之后添加到0.1 mol/L的磷酸氢二钠(Na2HPO4)溶液中, 保持(Ca+M)/P=1.67或Ca/(P+M) = 1.67。在磁力搅拌下向混合溶液添加硝酸(HNO3) (10.8 mol/L)和尿素(CON2H4)(0.56 mol/L), 将溶液的pH调节到2~3。形成透明的混合溶液后, 调节水热反应装置加热到150 ℃并保温3 h。高温高压环境导致尿素分解、pH增加至10~11, 使HA发生结晶。反应结束后冷却至室温, 离心(4000 r/min, 2 min)收集产品, 去离子水反复冲洗并干燥(70 ℃, 48 h)。根据加入到反应溶液中的元素掺杂浓度, 产物分别命名为1% M-HA、3% M-HA和5% M-HA。使用同样方法合成未掺杂的纯HA作为空白对照。所有试剂从长征试剂公司(中国成都)购买, 研究过程中均使用去离子水。
1.2 材料表征
使用扫描电子显微镜(SEM, FEI-Quanta-200)对样品表面形貌进行分析。采用X射线衍射(XRD, Panalyticx'Pert, Cu-Kα, 35 mA, 45 kV)研究样品相组成并分析样品的结晶度。采用傅里叶红外光谱仪(FT-IR, Thermo Nicolet5700)检测样品中所含官能团。采用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES, Spectro Arcos, Speicher)对掺杂元素进行定量检测。根据公式(1)计算每种元素的相对掺杂率(R)。
其中, χa为样品中元素的实际掺杂量; χt为样品中元素理论掺杂量。
2 结果与讨论
2.1 掺杂元素对产物形貌和晶相结构的影响
通过SEM对合成样品的表面形貌进行观察。未掺杂的纯HA表现出明显的条带状形态(图1(j1)), 与先前的报告一致[6]。掺杂的HA样品均显示出不同程度的形貌变化, 且与元素掺杂浓度相关。其中, Zn-HA和Mg-HA由条带状和球状晶体组成, 随着元素掺杂浓度增加, Zn-HA的球形直径从2~5 µm增大到8~10 µm, 形态趋向单一, 球形尺寸逐渐均匀(图1(a1~a3))[23]。而Mg-HA的条带和球型形貌产物含量比例发生变化, 球状颗粒数量趋向增加但直径减小(图1(c1~c3))。结合Zn和Mg掺杂HA形貌发现, 掺杂元素量增加过程中, 元素趋向占据全部晶胞的一个Ca位点后再取代第二个。因此会优先改变粒子形态, 在全部形貌都转变后, 再发生晶体长大的现象[24]。1%Fe-HA(图1(d1~d3))和 1%Si-HA (图 1(b1~b3))由带状晶体和球形颗粒组成, 但随着反应溶液中掺杂离子浓度的增加, 球形颗粒减少。特殊的是, Mn-HA呈现不规则块状颗粒(图1(e1~e3)), 颗粒尺寸随着Mn2+浓度的增加而减小至10~12 µm。对于Sr-HA、Se-HA、Co-HA三种元素掺杂HA样品, 可观察到随着掺杂离子浓度增加, 形貌逐渐从与纯HA相同的条带状转变为放射花瓣状, 且有继续堆叠形成球状颗粒的趋势(图 1(f1~f3), 1(g1~g3), 1(h1~h3))。Cu-HA同样由条带状和球形颗粒组成, 球形颗粒随着Cu2+含量的增加而变大(图 1(i1~i3)), 但形状不规则。
图1
图1
1%、3%和5%不同元素掺杂HA样品的SEM照片
Fig. 1
SEM images of hydroxyapatite samples doped by different elements at 1%, 3% and 5% doping amount
(a1-a3) Zn-HA; (b1-b3) Si-HA; (c1-c3) Mg-HA; (d1-d3) Fe-HA; (e1- e3) Mn-HA; (f1-f3) Sr-HA; (g1-g3) Se-HA; (h1-h3) Co-HA; (i1-i3) Cu-HA; (j1) HA
图2
图2
5%元素掺杂的样品在2θ=20°~70°范围内的XRD图谱
Fig. 2
XRD patterns from 2θ=20° to 70° of hydroxyapatite samples with 5% doping amount
表1 5%元素掺杂样品的结晶度及晶格参数
Table 1
| Sample | Crystallinity/% | a/Å | b/Å | c/Å |
|---|---|---|---|---|
| HA | 97.24 | 9.44 | 9.44 | 6.89 |
| 5%Zn-HA | 82.60 | 9.45 | 9.45 | 6.88 |
| 5%Si-HA | 95.19 | 9.43 | 9.43 | 6.88 |
| 5%Mg-HA | 85.75 | 9.45 | 9.45 | 6.88 |
| 5%Fe-HA | 95.40 | 9.44 | 9.44 | 6.89 |
| 5%Mn-HA | 94.01 | 9.42 | 9.42 | 6.87 |
| 5%Sr-HA | 85.37 | 9.44 | 9.44 | 6.90 |
| 5%Se-HA | 92.85 | 9.43 | 9.43 | 6.88 |
| 5%Co-HA | 92.31 | 9.43 | 9.43 | 6.88 |
| 5%Cu-HA | 91.15 | 9.45 | 9.45 | 6.88 |
2.2 掺杂离子半径与HA官能团和掺杂率的关系
采用FT-IR分析元素掺杂HA的官能团。由图3可见, 所有样品所含特征峰无明显差别, 均出现HA的官能团特征峰, 说明元素掺杂不对HA官能团构成影响。3400~3700 cm-1范围内的宽峰为材料表面吸附的H2O分子中H-O拉伸振动峰, 弯曲振动峰位于1639 cm-1处。元素掺杂HA全部显示PO43-中P-O的弯曲和拉伸振动峰, 分别位于564、602、958 cm-1和1034 cm-1位置[25]。此外, 样品在872、1416和1453 cm-1位置出现少量CO32-的C-O特征峰, 形成了部分碳酸根取代的碳酸磷灰石, 且结合文献[26]得知, 碳酸磷灰石生物相容性良好, 不影响掺杂HA的生物学功效。
图3
图3
5%不同元素掺杂HA样品官能团的FT-IR光谱图
Fig. 3
FT-IR spectra of functional groups of hydroxyapatites doped by different elements at 5% doping amount
图4
图4
5%元素掺杂样品的实际掺杂效率
Fig. 4
Actual doping efficiency of hydroxyapatite doped by different element at 5% doping amount
掺杂率与掺杂离子的半径和其他特性相关。如表2所示, 除Cu和Co以外的阳离子掺杂元素, 其离子半径越接近Ca2+的半径, 相对掺杂率越高。表明尺寸匹配是决定掺杂离子进入HA晶格能力的主要因素, 与替代掺杂理论的解释相同[27]。而Co2+由于氧化反应而影响掺杂行为, 是除离子半径之外的特殊因素。Fe3+没有因价态差异而无法掺杂进入HA中, 也没有实质性地改变其晶体形态, 其根本原因尚不清楚, 仍有待进一步研究。尽管Zn2+与Ca2+的半径更接近, 但Zn-HA和Mg-HA的相对掺杂率几乎相同, 反应溶液中的尿素在反应过程中分解生成的NH3, 会络合游离的Zn2+, 从而降低掺杂进入HA的Zn2+浓度。同样, NH3与Cu2+之间的强络合作用也解释了Cu-HA的相对掺杂率明显较低[28]的原因。硅元素和硒元素分别以硅酸盐阴离子(SiO32-)和亚硒酸盐阴离子(SeO32-)的形式存在[29], 在HA中的掺杂率较低。首先, 可能由于Si与C为同主族元素, SiO32-代替PO42-的情况与形成碳酸磷灰石的情况近似, SiO32-与CO32-同带负二价电荷且为三角锥体构型[30]。因此推测, SeO32-和SiO32-偏离了在HA晶体中所替代的PO43-的负三价电荷及四面体几何结构(图5), 从而在与相邻的Ca2+配位时会产生不可避免的位错。其次, 由于pH的变化, SiO32-会自动缩合成低聚阴离子, 这些阴离子与HA晶格中的几何构型不匹配, 导致其结合较差, 因此Si的元素掺杂效率较Se更低。在HA材料中掺杂的功能化氧阴离子相对较少, 因此本研究仅对Si和Se作了研究。然而, 对阴离子掺杂HA(包括非氧阴离子如Cl-, F-等)需要在后续研究中开展。
表2 Ca2+和所掺杂阳离子的离子(原子)半径尺寸
Table 2
| Ion | Radius dimension/nm |
|---|---|
| Ca2+ | 0.099 |
| Sr2+ | 0.113 |
| Mn2+ | 0.080 |
| Co2+ | 0.074 |
| Zn2+ | 0.074 |
| Cu2+ | 0.072 |
| Mg2+ | 0.065 |
| Fe3+ | 0.064 |
图5
图5
磷酸根离子和正硅酸根离子的空间构型
Fig. 5
Spatial configurations of phosphate ion and n-silicate ion
3 结论
通过六位一体平行水热合成装置, 合成并研究了锌、硅、镁、铁、锰、铜、硒、锶、钴九种元素在HA中的掺杂行为及其对产物特性的影响。九种元素均成功掺杂, 进入HA晶格。元素掺杂影响了晶体粒子的形貌, 降低了结晶度, 但不改变其HA物相结构和特征官能团。元素相对掺杂率的大小排序为: Mn>Zn>Mg>Fe(三价)>Sr>Co>Cu>Se>Si, 其主要的决定因素为掺杂离子半径与Ca2+半径的尺寸差异。此外, Co的氧化反应、Cu与氨的络合作用也分别影响其掺杂行为, Si和Se的实际掺杂量较低是由于SiO32-和SeO32-与HA中PO43-基团的电荷及空间构型差异。本研究主要涉及金属阳离子和部分含氧阴离子元素, 对其他元素如稀土元素、卤族元素等特殊元素掺杂还有待探究。本研究针对元素与掺杂行为关系的研究, 揭示了HA掺杂与离子特性之间的联系, 为设计和开发功能性元素掺杂的HA基材料提供了理论支持。
参考文献
Ionic substitutions in calcium phosphates synthesized at low temperature
Bone formation controlled by biologically relevant inorganic ions: role and controlled delivery from phosphate-based glasses
Investigation on in vitro osteogenic properties of malti-doped hydroxyapatite with natural bone content
Cu-doping of calcium phosphate bioceramics: from mechanism to the control of cytotoxicity
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