钛及其合金具有良好的生物相容性及力学性能, 是应用广泛的人体硬组织替代材料^[1]。未经活化的钛表面生物活性低, 与骨组织间只是简单的机械互锁, 无法形成骨整合, 导致愈合周期长, 也增大了手术失败率^[2]。大颗粒喷砂酸蚀(Sandblasted, Large- grit, Acid-etched, SLA)是钛基牙种植体最常用的表面处理方法, 形成的三维多级嵌套孔洞结构有效增加了种植体表面粗糙度, 获得了良好的亲水性表面, 增强了植入体与机体的机械锁合^[3-4]。但是, 这种方法仍然是被动模仿人骨表面微观形貌, 不能主动诱导类骨羟基磷灰石的沉积或是直接改善表面细胞活性。

生物化学表面改性将蛋白质、酶、多肽及细胞生长因子等生物大分子固定于植入体表面, 诱导特异性生物反应, 抑制非特异性生物反应^[5]。Lee等^[6]研究发现, 含有儿茶酚官能团和赖氨酸端氨基官能团的多巴胺(Dopamine)在碱性条件下, 可在玻璃、金属、陶瓷、有机物等材料表面形成具有超强粘附性的聚多巴胺(Polydopamine, PDA)薄膜。PDA可将生物大分子固定在材料表面, 进行功能性二次修饰^[7-8]。近年来, 很多研究利用PDA将RGD肽^[9]、肝素、酶^[10]、骨形态发生蛋白(BMP-2)^[11]、细胞生长因子^[12]等固定于植入体材料表面进行生物化学改性研究。

酪蛋白磷酸肽(Casein phosphopeptides, CPP)被称为“矿质载体”, 是目前唯一一种促进钙吸收的活性肽^[13]。CPP中的磷酸丝氨酸能够与钙离子结合成可溶性复合物, 提高局部钙含量, 促进羟基磷灰石的沉积^[14], 增强成骨细胞的粘附与增殖^[15]。此外, CPP还可减弱破骨细胞的作用, 使得成骨细胞在骨代谢中起主导作用, 阻止矿物质的流失并抑制骨的再吸收^[16]。

本工作在SLA三维多级嵌套孔洞结构表面, 通过两步浸泡法制备PDA/CPP复合活性涂层, 目的在于用生物化学表面改性方法进一步修饰具有高比表面积的SLA表面, 增加植入体表面骨整合主动性, 提升生物活化效果。

1 实验方法

1.1 样品的制备与材料学表征

对圆片状纯钛(TA2)基底打磨清洗后, 使用二氧化钛沙砾喷砂至表面呈均匀深灰色, 清洗吹干; 用混酸(8%盐酸, 32%硫酸)60℃恒温腐蚀45 min, 清洗吹干, 该样品记为SLA。将多巴胺盐酸盐溶于Tris-HCl缓冲溶液中, 配制pH=8.5, 浓度为2 mg/mL的多巴胺溶液; 将CPP溶于含有0.1 mol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、20 mmol/L N-羟基酰亚胺(EDS)、50 mmol/L 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDS)的溶液中, 配制浓度为10 g/L的CPP溶液。SLA样品先在多巴胺溶液中浸泡24 h, 然后在CPP溶液中浸泡16 h, 取出后用PBS缓冲溶液(pH=7.4)冲洗并吹干, 所得样品记为SLA/PDA/CPP。

采用场发射扫描电子显微镜(FESEM, LEO1550, 德国)观察样品表面形貌; 采用X射线光电子能谱仪(XPS, PHI Quantera Ⅱ, 日本)分析样品表面成分组成; 采用接触角测量仪(JC2000D7M)测量样品表面与蒸馏水的静态接触角。

1.2 体外仿生矿化实验

将样品浸泡于模拟体液(Simulated body fluid, SBF)^[17](1 : 1, pH=7.4, 37.5℃)中, 每48 h更换模拟体液, 浸泡1、3、5、7 d分别取出一个样品。采用FESEM及能谱仪(EDS)分析表面仿生矿化情况。

1.3 生物细胞实验

1.3.1 细胞粘附

设置空白组(无细胞无钛片)、对照组(有细胞无钛片)、SLA及SLA/PDA/CPP四个组, 每组六个副孔, 置于48孔板底, 以3×10⁴个/孔接种P4代hBMSCs, 接种面积为8 mm×8 mm, 在37℃, 5%CO₂浓度以及100%湿度下进行培养。培养1、2、6和24 h四个时间点分别用PBS轻洗孔底未贴壁的细胞, 更换完全培养基500 μL; 24 h之后更换培养体系为200 μL, 避光加入20 μL CCK-8试剂, 孵育4 h; 震荡均匀, 从每孔中吸取150 μL转移至96孔板, 在450 nm下用酶标仪分别测定吸光度, 读取并记录OD值, 计算粘附率。

1.3.2 细胞增殖

同1.3.1培养hBMSCs, 在3、5和7 d三个时间点更换培养体系为200 μL, 避光加入20 μL CCK-8试剂, 在孵箱中孵育4 h; 震荡均匀, 从每孔中吸取150 μL转移至96孔板; 用酶标仪在450 nm下分别测定吸光度, 读取并记录OD值, 计算细胞增殖率。

1.3.3 细胞矿化

同1.3.1培养hBMSCs 3~5 d, 接种面积为2 cm× 2 cm; 吸弃培养液, PBS漂洗3遍; 每孔中加入100 μL 0.25%的Triton X-100, 再加入200 μL碱式磷酸酶(ALP), 37℃孵育1 h; 在410 nm波长下使用酶标仪测取OD值, 计算ALP浓度。

采用单因素方差分析的检验方法对文中所有数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 表面形貌

喷砂酸蚀得到的SLA三维多级嵌套孔洞结构表面形貌如图1(a)所示, 孔洞结构类似蜂窝状, 直径十几到几十微米的大孔洞嵌套着直径几微米的小孔洞结构, 小孔洞内部还存在一些纳米级凹凸结构。改性后的SLA/PDA/CPP表面肉眼可见颜色变为深棕色, 微观形貌如图1(b)所示, 具有一定厚度的涂层紧贴基底表面, 尖锐的孔洞边界变得柔和, 微纳复合的孔洞结构仍然存在, 但是表面孔洞明显变少, 深度变浅。

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图1   改性前后SLA表面FESEM照片

Fig. 1   FESEM images of SLA surfaces before and after PDA/ CPP modification
(a) SLA; (b) SLA/PDA/CPP

2.2 表面成分

图2(A)和(B)是改性前后SLA表面XPS全谱图。改性后的表面Ti2p基本消失, 可见基底表面TiO₂层被覆盖; N1s特征峰显著增强, 其归属于PDA及CPP中的氨基和酰胺键; 同时出现了P2s和P2p特征峰, 它们归属于CPP中的磷酸基团。

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图2   改性前后SLA表面XPS全谱图及C1s高分辨率图谱

Fig. 2   XPS wide scan spectra (A, B) and high resolution spectra of C1s (a, b) of SLA surfaces before (A, a) and after (B, b) PDA/CPP modification

图2(a)和(b)是改性前后SLA表面C1s高分辨率图谱。SLA/PDA/CPP表面出现了C=C, 这归属于PDA中存在的大量苯环; 同时, C-N及C=O所占面积比明显增加, 它们归属于PDA中的氨基及其聚合过程中残留的醌基, 以及CPP中包含的大量肽键(酰胺键)。

综上可知, 先后浸泡碱性多巴胺溶液及CPP溶液, 在SLA表面成功制得了PDA/CPP复合涂层。

2.3 亲水性

由接触角测量仪测得SLA及SLA/PDA/CPP表面平均水接触角分别为47.7°及25.5°。SLA表面原本粗糙度及表面能较高, 亲水性良好; PDA为SLA表面引入了酚羟基以及氨基亲水基团, CPP也含有大量羟基、羧基、氨基等亲水基团, 使得SLA表面接触角降低22.2°, 亲水性进一步改善。

2.4 仿生矿化性能

浸泡SBF溶液后, 试样表面沉积了白色疏松球状颗粒, 与羟基磷灰石的形态一致。对此白色沉积物进行EDS分析可知, 表面沉积物中主要含有P、Ca和O元素, 钙磷原子比(Ca/P)为1.67, 与羟基磷灰石原子比1.67一致, 证明表面沉积的是羟基磷灰石(HA)。

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图3   SLA(A)和SLA/PDA/CPP(B)在SBF溶液分别浸泡1、3、5、7 d后表面的FESEM照片

Fig. 3   FESEM images of SLA (A) and SLA/PDA/CPP (B) immersed in SBF solution for 1, 3, 5 and 7 d

如图3所示, 在SBF溶液浸泡1 d之后, SLA表面形貌未发生明显改变, 直到浸泡7 d后的SLA表面才被平整的HA层完全覆盖, 并且存在严重开裂。SLA/PDA/CPP样品表面浸泡SBF溶液1 d之后即生长出大量的球状HA, 细小的HA颗粒紧贴基底孔洞内壁以及孔洞边界生长, 基底的三维多孔形貌保存良好; 浸泡3、5及7 d后, 表面HA颗粒尺寸逐渐变大, 没有产生明显裂纹。可见, SLA/PDA/CPP表面HA形核及长大的速度快, 数量多, HA层与基底结合紧密且稳定, 说明PDA/CPP复合涂层能够显著改善基底表面生物矿化性能。这是由于亲水的多孔钛表面能够迅速被SBF浸润, 表面CPP涂层中的磷酸丝氨酸能够与Ca²⁺形成可溶性复合物, 增加试样周围游离Ca²⁺的浓度; 均匀分布于多孔钛表面的磷酸丝氨酸起模板剂作用, 为HA提供密集的形核位点; HA中的Ca²⁺与基底表面PDA/CPP复合涂层之间的共价结合同时也增加了界面结合强度。球状HA颗粒尺寸小, 较为独立, 内应力小, 因此HA层稳定, 不容易破裂。

2.5 细胞粘附

如图4所示, SLA表面在1、2、6、24 h四个时间点的细胞粘附率基本稳定在1.00左右; SLA/ PDA/CPP表面2 h的细胞粘附率高达5.11, 1 h与6 h的细胞粘附率都超过2.00, 与同时间点的SLA表面细胞粘附率之间存在显著统计学差异(p<0.01); 24 h的细胞粘附率略高于SLA表面, 二者不存在统计学差异。结果表明, SLA/PDA/CPP表面早期细胞粘附率整体高于SLA表面, PDA/CPP复合涂层能够促进SLA表面早期细胞粘附, 原因在于：(1) PDA/CPP涂层并未改变SLA钛基底的多孔形貌, 其有利于细胞伪足的攀附; (2) CPP是不同氨基酸组成的生物活性短钛, 易于与细胞表面的整合素结合^[18-20]; (3) CPP表面的氨基、羧基等官能团与细胞表面有机物质发生反应, 促进伪足的形成, 从而有利于细胞粘附。

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图4   改性前后SLA表面细胞粘附率测试结果, **表示两组数据之间存在显著统计学差异(p<0.01)

Fig. 4   Cell Attachment rates on SLA surfaces before and after PDA/CPP modification, with ** indicating a highly statistically significant difference (p<0.01)

2.6 细胞增殖

如图5所示, 在三个时间点, PDA/CPP改性后的SLA表面细胞增殖率都大于改性前的SLA表面, 并且每组数据之间都存在显著统计学差异(p<0.01)。随着细胞孵育时间的延长, SLA及SLA/PDA/CPP表面的细胞增殖率都逐渐增加, SLA表面5 d的细胞增殖率相比于3 d增加了0.18, 7 d的细胞增殖率相比于5 d增加了0.39; 而SLA/PDA/CPP表面5 d的细胞增殖率相比于3 d增加了0.33, 7 d的细胞增殖率相比于5 d增加了0.57。可见PDA/CPP复合涂层不仅能够提高表面细胞增殖率, 而且能够加快细胞增殖的速率。这是因为CPP中的磷酸丝氨酸与Ca²⁺可形成可溶性复合物, 使得试样表面Ca²⁺富集^[15], 高钙状态能够协同为细胞迁移产生动力的肌动蛋白丝, 促进细胞的迁移, 从而改善细胞增殖活性^[21]。

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图5   改性前后SLA表面细胞增殖率测试结果, **表示两组数据之间存在显著统计学差异(p<0.01)

Fig. 5   Cell proliferation on SLA surfaces before and after PDA/CPP modification, with ** indicating a highly statistically significant difference (p<0.01)

2.7 早期ALP活性分析

碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶, ALP的活性可以反映成骨细胞分化过程的早期矿化程度。改性前后SLA表面ALP活性检测数据显示, SLA/PDA/CPP表面ALP浓度大于SLA表面, 两组数据之间存在显著统计学差异(p<0.01), 说明PDA/ CPP对细胞矿化同样有促进作用。这主要是由于高钙浓度是成骨细胞形成的重要条件^[22], CPP中磷酸丝氨酸促进生理环境中Ca²⁺在试样表面的富集, 促进hBMSCs向成骨细胞分化, 因而改善了细胞矿化活性。

3 结论

通过两步浸泡法, 在SLA表面成功制备了PDA/CPP复合涂层, 同时保留了SLA原有的三维多级嵌套孔洞结构。该涂层使SLA表面水接触角从47.7°降低至25.5°, 有效提高了表面亲水性; 将诱导羟基磷灰石层形成的时间由7 d缩短至1 d, 显著加快了表面生物矿化的速度; 生成的HA层致密且无裂痕, 可见PDA/CPP复合涂层促进了类骨羟基磷灰石与基底界面的结合。同时, 生物细胞实验显示, PDA/CPP能够有效提高细胞早期粘附率、增殖率以及矿化活性。该工艺简易有效, 将生物化学改性方法结合于物理化学改性之上, 效果显著。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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