南极假丝酵母脂肪酶B(CALB, Sigma公司), TEOS(高纯, 天津科密欧化学试剂有限公司), γ -缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560, 98%, 成都晨光化工研究院), Pluronic F127(EO₁₀₆PO₇₀EO₁₀₆, Sigma公司), 其它试剂均为市售分析纯。

Thermo Nicolet 670傅里叶红外光谱仪(美国尼高力仪器公司), UV-3100PC型紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司), GC4000A气相色谱仪(北京东西电子有限公司), Quadrasorb SI比表面分析仪(美国康塔公司), HCT-2热重分析仪(北京恒久科学仪器厂)。

1.2.1 SiO₂载体制备

根据文献[12]报道方法, 将由TEOS制得的3%溶胶40℃旋蒸30 min, 研磨得SiO₂颗粒(U-S)。

1.2.2 改性SiO₂载体制备

向100 mL 3%(w/w)的SiO₂溶胶中加入1.5 g 98%的KH560、1 g 氨水、0.3 g F127, 30 ℃搅拌3 h, 室温陈化3 d。旋蒸出乙醇, 固体粉末用无水乙醇洗涤, 230 ℃焙烧6 h, 得到以F127为模板的KH560修饰SiO₂(F-560-S)。未添加F127的KH560修饰二氧化硅样品记为560-S。

取载体0.24 g, 加入8 mL 15 mg/mL的CALB溶液中, 25 ℃, 180 r/min摇床振荡12 h, 5000 r/min离心, 去离子水洗涤固体三次, 收集上清液。冻干固体, 得到粉末状固定化CALB。

按照Bradford法测定上清液吸光度^[13], 按下述公式计算固载量:

A₁、A₂分别为固定化前后酶液与Bradford试剂显色吸光度值。

在15 mL西林瓶中分别加入4.2 mL溶剂(正己烷或其它溶剂), 1.2 mL 1-苯乙醇和4.6 mL醋酸乙烯酯, 再加入按固载量折算为15 mg游离酶当量的固定化酶或15 mg的游离酶(F-CALB)。将西林瓶置于0~60℃ 250 r/min气浴摇床中反应。取反应1~48 h后上层液体, 使用气相色谱分析产物组成。色谱柱: Grace EC-WAX; 程序升温60/(3)-20℃/min-240/(3); 进样口温度250 ℃; 进样量0.4 μ L。

取15 mg游离酶当量的固定化酶放于正己烷中反应12 h后过滤, 正己烷洗涤, 干燥后用于下一次反应。使用气相色谱分析滤液组成。

2.1.1 载体热重及红外分析

图1为560-S和F-560-S的热失重曲线。由图可知, F-560-S在约200~240 ℃及250~300 ℃间存在两个失重过程, 而560-S从约260℃开始失重。这表明加热过程中F127先于KH560分解。因此控制修饰载体烧结温度为230℃, 选择性去除F127而保留KH560。

红外图谱(图2)进一步证实烧结后SiO₂存在环氧基。由图2可以看出, 3450.6 cm^-1对应硅羟基上O-H的伸缩振动吸收峰, 2943.3和2843.0 cm^-1对应KH560硅烷链上甲基和亚甲基的伸缩振动吸收峰。比较样品U-S和F-560-S可见, 随着KH560的加入, 硅羟基吸收峰减弱, 而甲基和亚甲基的吸收峰增强。

环氧基含量可以通过Na₂S₂O₃滴定法测定。Na₂S₂O₃与环氧基反应后生成的OH^-用标准HCl滴定, 结果表明: F-560-S烧结前后环氧基含量分别为225和256 μ mol/g。可见, 230℃烧结之后载体表面仍然含有KH560。

图1

Fig. 1

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	图1 560-S(A)和F-560-S(B)的TG曲线Fig. 1 TG curves of 560-S (A) and F-560-S (B)

图2

Fig. 2

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	图2 KH560修饰前后SiO2的红外图谱Fig. 2 FT-IR spectra of silica before and after KH560 modification(A: KH560; B: U-S; C: F-560-S)

2.1.2 载体微观形貌和孔结构

图3为U-S 和F-560-S在不同放大倍数下的SEM照片。从图3(a)可见, 未改性SiO₂颗粒粗大, 表面光滑, 进一步观察(图3(b))可见, 其表面不具有孔隙, 且粒径较大。而F-560-S烧结后, 粗大的SiO₂颗粒消失(图3(c)), 细小的颗粒相互堆积, 形成丰富的堆积孔道结构(图3(d))。

表1比较了改性前后SiO₂载体孔结构变化情况, 可以看出, KH560修饰使得SiO₂载体比表面积、孔容和孔径均略有下降。F-560-S的孔结构参数明显高于U-S和560-S。这是因为在凝胶过程中SiO₂粒子堆积于F127表面, 粒子间相对距离增加^[14]。烧去F127后SiO₂微观结构仍基本上保持完好。因此F-560-S具有较大的孔径。

图3

Fig. 3

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	图3 不同放大倍率下改性前后二氧化硅的SEM照片Fig. 3 Low (a, c) and high (b, d) magnification SEM images of different silica support((a) and (b): U-S; (c) and (d): F-560-S)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 改性前后二氧化硅载体孔结构参数 Table 1 Surface properties of silica support before and after modification Sample ABET /(m2• g-1) Pore Volume/(cm3• g-1) Pore size/nm U-S 538 0.563 3.9 560-S 455 0.545 3.2 F-560-S 725 0.709 10.3

表1 改性前后二氧化硅载体孔结构参数 Table 1 Surface properties of silica support before and after modification

含环氧官能团的介孔载体对脂肪酶的固定分两步进行^[15]: 载体先通过范德华力吸附脂肪酶, 而后环氧基开环与酶上非活性位点的氨基形成稳定的化学键。Takahashi等^[16]研究表明, 在载体大小相当的情况下, 载体与酶间作用力越强, 载体所能吸附的酶越多。由图4可见, 普通SiO₂对CALB吸附能力较弱, 固载量仅为10 mg/g support。对于普通的SiO₂而言, 固定化仅通过范德华力、氢键和静电作用完成。经过KH560修饰的载体与CALB分子间的结合除了物理吸附作用, 还有化学键合作用, KH560减小了酶分子在反复摇晃和冲洗过程中的脱落, 因此载体对CALB的结合能力有了明显的提升, 固载量达到104 mg/g support。引入F127作为扩孔材料后, 载体对CALB的固载量再次提升, 达到375 mg/g support, 这可归因于F-560-S较高的孔结构参数。Lei等^[17]认为, 载体表面形貌对其固定化能力有重要的影响, 载体表面孔隙越丰富, 其容纳酶的空间也越多, 固定化能力就越强。

使用催化1-苯乙醇与醋酸乙烯酯的转酯化反应来表征不同CALB的催化性能(式1), 并以此考察载体对CALB催化活力的影响。

图5是不同CALB催化1-苯乙醇与醋酸乙烯酯反应转化率随反应时间的变化关系。与游离酶相比, 固定化酶在有机相中的催化活力得到明显提高, 这与催化剂在反应底物中的状态有密切关系; 游离CALB在有机相中易团聚, 而固定化酶分散性好, 短时间放置, 固载酶也不易沉积; 另一方面, 固定化过程改变了脂肪酶结构, 保持了活力构型, 因而酶活有了极大提高^[18]。F-560-S固定的CALB与U-S固定的CALB相比, 1 h反应转化率略有提升, 反应12 h, 转化率达到53.85%, 趋于稳定。这表明KH560不影响酶活表达, 与CALB相容性好。

图4

Fig. 4

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	图4 改性前后SiO2对CALB固载量(mg/g support)的比较Fig. 4 Lipase absorbed amount (mg/g support) of immobilized lipases on difference supports

图9

Fig. 49

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	图9 （式1） 1-苯乙醇与醋酸乙烯酯的转酯化反应Fig. 49 （Scheme 1） Transesterification of 1-phenylethanol and vinyl acetate

重复使用性是任何固定化酶在应用上必须考虑的重要因素。图6比较了三种载体固定的CALB多次催化1-苯乙醇与醋酸乙烯酯反应后活力保持情况。

图5

Fig. 5

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	图5 不同CALB催化1-苯乙醇与醋酸乙烯酯反应转化率随时间的变化关系Fig. 5 Conversion of transesterification of 1-phenethanol and vinyl acetate using CALBs as biocatalysts ((■) CALB immobilized on F-560-S; (□) CALB immobilized on 560-S; (●) CALB immobilized on U-S; (★) free CALB)

图6

Fig. 6

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	图6 固定化CALB的重复使用性Fig. 6 Reusability of the immobilized CALBs (■) CALB immobilized on F-560-S; ( (□) CALB immobilized on 560-S; (●) CALB immobilized on U-S)

载体与酶之间形成化学键是一种最为稳定的固定化方式, 同时载体与酶间形成多点键合是提高固定化酶重复使用性的重要因素^[19]。从图6可以看出, U-S通过物理吸附固定的CALB重复使用七次后, 剩余酶活仅为初始酶活的50.5%, 这是由于酶分子仅仅依靠物理吸附方式吸附于载体材料上, 因而在多次操作过程中易于脱落^[20]。U-S经过修饰后, 固定化酶的重复使用性明显提高, 重复使用7次后以F-560-S为载体的固定化CALB活力仍为初始活力的88.3%。CALB的水解/酯化催化活性位点为Ser- His-Asp三联体^[21], KH560修饰的SiO₂, 固定化过程主要通过环氧基与酶分子赖氨酸(Lys)残基上的氨基键合完成^[10], 而不影响CALB的活性位点。因此KH560在保证酶活的同时, 又实现了载体与酶的稳定结合。在560-S基础上, 加入F127使得载体堆积孔更多, 形貌更加丰富。Zhou等^[22]认为, 具有弯曲结构的载体对酶的结合更为牢固。因此经过多次冲洗、反应后, F-560-S上的CALB流失较少, 仍具有较高的催化活力。

溶剂极性及自身毒理特性对生物酶活力有至关重要的影响, 酶通过“ 必需水” 保持其构象变化所需的柔性, 进而在有机溶剂中表现出催化活性。由于极性溶剂与水的结合能力强于非极性溶剂, 因此在非水相反应中, 以疏水性较强的溶剂为反应介质可以观察到较高的酶催化活力^[23]。图7比较了固定在不同载体上的CALB在甲苯、叔丁醇、四氢呋喃、吡啶、DMSO、DMSO-80%甲苯和DMSO-80%叔丁醇混合溶液中催化1-苯乙醇与醋酸乙烯酯反应的结果。前五种溶剂极性依次增强, 且均高于正己烷。由图7可见, 固定化酶在甲苯、叔丁醇、四氢呋喃、吡啶、DMSO-80%甲苯、DMSO-80%叔丁醇混合溶液中均表现出了一定的催化活力, 但在极性最强的DMSO中, 三种固定化酶均失活。这是由于DMSO的极性过强, 夺取了酶分子中的结合水, 使得酶构象发生变化而造成的^[24]。因此在DMSO中混入80%甲苯或80%叔丁醇后, 固定化酶再次恢复催化活力。SiO₂经过KH560修饰后, 固定CALB的催化活力在除DMSO以外的其他溶剂中均有明显提高。加入F127改变载体形貌后, 固定化酶的催化活力进一步提高, 在极性较强的吡啶中, 560-S和F-560-S固定的CALB对目标反应的催化转化率分别为36.9%和38.8%, 而U-S固定的CALB仅为8%。这表明KH560和载体形貌共同影响固定化CALB 的催化活力: 一方面KH560与CALB间形成共价键改变了酶分子结构; 另一方面载体微环境的改变能够减弱有机溶剂对酶必须水的结合能力, 保护酶的活力构型^[18]。

图7

Fig. 7

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	图7 溶剂对固定化CALB催化活力的影响Fig. 7 Effect of solvents on transesterification of the immobilized CALBs

以正己烷为溶剂, 分别考察0~60℃下CALB催化性能的变化。图8为不同温度下CALB催化1-苯乙醇和醋酸乙烯酯反应的转化率。随着温度升高, 酶的催化活力随之提升。与游离酶相比, 固定化CALB的催化活力在0~60℃温度范围内都有极大提高, 表明CALB经过固定化后热稳定性得到了显著改善。当温度超过40℃时, F-560-S固定的CALB催化手性醇的转化率即超过了50%, 这是因为在酶能够保持正常活力的情况下, 提高温度降低了酶的手性选择能力^[25], 高温条件下酶同样可催化(S)-1-苯乙醇转参与酯化反应。经过KH560修饰的SiO₂, 由于载体与酶分子的共价键键合强于U-S的物理吸附作用, 使得酶分子构象不易受温度影响, 固定化酶活力有所提高。加入F127改变了载体形貌, 进一步提高了固定化CALB的热稳定性。

图8

Fig. 8

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	图8 温度对固定化CALB催化活力的影响Fig. 8 Effect of temperature on transesterification of the immobilized CALBs ( (■) CALB immobilized on F-560-S; (□) CALB immobilized on 560-S; (●) CALB immobilized on U-S; (★) free CALB)