磷酸钙骨水泥(CPC)由等摩尔比的磷酸四钙(TECP, 上海瑞邦生物材料有限公司)和无水磷酸钙(DCPA, 上海瑞邦生物材料有限公司)混合而成。

固化液的制备: 分别称取11.1、25.0和66.7 g柠檬酸(分析纯, 凌峰化学试剂有限公司)添加到100 g超纯水(实验室自制)中, 在常温下搅拌30 min, 配成10%、20%和40%质量百分比浓度的柠檬酸溶液, 然后分别称取上述四种溶液98 g, 加入2 g壳聚糖(Sigma-Aldrich, Mn=50万), 在常温下搅拌24 h确保壳聚糖充分溶解, 获得均匀的柠檬酸壳聚糖固化液。将固化液密封低温保存备用。

模拟体液(SBF)配制^{[ 14]}: 将K₂HPO₄·3H₂O、NaHCO₃、CaCl₂、MgCl₂·6H₂O、KCI、NaCl按一定浓度配成溶液, 加入0.03 mol/L的Tris生物试剂作缓冲液, 再用浓盐酸调节pH值至7.5, 该溶液即为模拟体液。

固化液中柠檬酸含量为0、10%、20%和40%; 壳聚糖含量为2%。将固相CPC粉末和固化液按固液比为0.5~1.0 mL/g混合均匀, 然后进行粘结剂的测试。

将粉料与固化液按0.5~1.0 mL/g 的液固比混合均匀, 填入φ6 mm×20 mm的不锈钢模具(自制)中, 施压2 kg以尽可能去除气泡。样条取出后即放入100%相对湿度、37℃环境中, 固化3 d后取出, 两端面用细砂纸磨平, 然后由万能材料试验机(HY-1080 , 上海衡翼公司)测量压缩强度。载荷速度为1 mm/min, 最大压力为2000 N, 每组数据至少有3个平行试样。

将CPC粉末与含不同柠檬酸配比的固化液以按0.5~1.0 mL/g充分混合后放入模拟体液中, 然后置于振荡箱(100 r/min)中振荡24 h, 观察其表面是否脱落。振荡24 h后将样品取出, 在60℃烘箱里干燥24 h, 称重, 以CPC的失重情况衡量材料的抗水性能。

骨水泥粉料与固化液按0.5~1.0 mL/g 的液固比混合均匀, 将调和好的浆体填入φ6 mm×10 mm的小玻璃管中(尽量填实), 一头抹平, 然后将两端用塑料薄膜封闭, 放入100%相对湿度、37℃环境(恒温恒湿箱, 上海一恒实验设备有限公司)中, 采用水泥稠度及凝结时间测定仪(即维卡仪, 无锡建筑材料仪器机械厂)测量凝结时间。测定凝结时间时, 在金属圆棒的下端装上直径1.1 mm 的试针, 滑动部分总重量为(300 ± 2)g。测定时将样品置于底板上使试针与浆体表面接触, 突然松开松紧螺丝, 试针自由沉入浆体, 观察指针指示数值。从加入固化液起, 至试针沉入浆体不超过1 mm时, 所需时间即为凝结时间。每组数据重复3次。

将粉料与固化液按0.5~1.0 mL/g的液固比混合均匀, 填入硅胶或不锈钢模具中, 置于100%相对湿度、37℃环境中养护72 h, 即得骨水泥样品。将样品置于80℃干燥箱(电热恒温鼓风干燥箱, DHG- 9203A, 上海精宏实验设备有限公司)内干燥, 然后用玛瑙研钵粉碎至无颗粒感, 再次放入干燥箱内干燥。将样品粉末用“压片法”制成试片, 使用转靶X射线多晶衍射仪(D/MAX 2550 VB/PC, 日本Rigaku公司)进行广角X射线衍射分析(XRD, Cu 靶, 扫描速度8°/min)。

取新鲜猪骨, 制成40 mm×25 mm×5 mm样条。采用剪切强度表征胶粘剂的粘合性能。胶粘剂的剪切强度是反映其胶接强度的主要指标, 用以表征与胶层平面平行方向上抵抗应力的强度。测试其剪切强度方法如图1所示。

图1

Fig. 1

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	图1 骨块胶粘强度测试示意图Fig. 1 Schematic illustration of cohesion test

将骨块一端用细钢丝固定于加力架上, 粘合的另一骨块用细钢丝系于测力计上。先将配置好的骨粘接剂涂抹在小骨块的一端约1/3, 按压使骨块间多余的凝胶溢出, 两个小骨块充分贴合为一对, 每实验组包括5对平行试样。分别测试不同柠檬酸浓度下的剪切强度。于粘合后6 h对各组骨块的粘合力进行测试, 记录相应各组的粘合剂抗拉力大小(F); 并用千分尺分别测得各组中每块骨粘合部分的长度和宽度, 计算粘合面积( S)。根据公式 σ＝ F/ S计算出粘合应力的大小。

固化72 h后的材料用环氧乙烷灭菌备用。骨粘接剂固化消毒后放入装有成骨诱导DMEM 培养液的培养管中, 置于37℃、100%相对湿度、5 % CO₂ 培养箱中24 h, 取出后, 吸干材料表面培养液备用. 取第4代对数生长期MC3T3-E1(中科院细胞库), 胰酶消化、离心收集后, 制备成1 × 10⁶ cells/mL 浓度的细胞悬液, 滴加于材料中至饱和. 将吸收细胞悬液的材料置于37℃、100%相对湿度、5% CO₂ 培养箱中培养4 h, 再将培养皿中的培养液加至正常培养用量, 继续置于37℃、100%相对湿度、5% CO₂ 培养箱中分别培养8 h. 然后将材料和细胞的复合体取出, 以PBS 轻轻洗涤3 次, 置于2%多聚甲醛 - 2.5%戊二醛中固定30 min, 然后用50%、70%、90%、100%酒精逐级脱水后, 放入扫描电镜(JSM-6360LV, 日本JEOL公司)观察细胞形貌。

随着水化反应的进行, 羟基磷灰石细小晶体不断长大并相互接触。晶体越大, 接触点数量越多, 固化体越坚硬, 强度越高。磷酸钙骨水泥体系中固化液的作用一是作为固体颗粒间的连接介质, 使其处于粘连状态; 二是作为反应的介质。从抗压强度结果(图2)可以看出, 抗压强度随着柠檬酸的含量提高而提高。这一结果同Barralet等^{[ 15]}关于α-羟基酸对CPC抗压强度的影响相符。柠檬酸也属于α-羟基酸, 羟基酸体系在钙离子的作用下可产生更多的自由离子, 而这些自由离子会吸附在反应物及固化生成物的粒子表面, 进而增大ζ势能, 提高了骨水泥流变性能, 在保持骨水泥可操作性的同时降低其固化所需的水含量, 进而导致骨水泥孔隙率下降, 强度提高。

图2

Fig. 2

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	图2 柠檬酸浓度对CPCBA压缩强度的影响Fig. 2 Effect of citric acid concentration on compressive strength of CPCBA

为避免手术时伤口处渗出的血液将未固化完全的骨水泥粉末冲散, 影响其性能并产生安全隐患, 要求骨粘合剂应具有良好的抗水性能。传统的磷酸钙骨水泥在调和时, 由于水分产生的毛细孔隙的直径一般为几十至几百纳米, 水分子可以自由渗入, 导致尚未固化的骨水泥溃散, 抗水性能不理想。引入抗水剂是提高材料抗水性能的有效手段, 实现堵塞孔隙, 阻止渗水。

图3是不同柠檬酸含量的固化液与CPC调和后, 浸泡于SBF中在振荡箱震荡24 h后的照片。从图中可以看出不含柠檬酸的CPC有较多的粉末溃散, 添加10%柠檬酸的样品有少量掉渣的现象, 而添加20%和40%的样品几乎没有掉渣的现象, SBF溶液澄清。

图3

Fig. 3

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	图3 固化液中柠檬酸含量对抗水性能的影响Fig. 3 Effect of citric acid concentration on antiwashout(A) No citric acid; (B) 10% citric acid; (C) 20% citric acid; (D) 40% citric acid

通过试样干燥后称重, 可定量反映抗水性。由图4可以看出, 随着柠檬酸的加入, 抗水性得到有效的改善, 不添加柠檬酸的样品失重率达到14.5%, 添加10%的柠檬酸失重率减少到8.6%, 添加20%和40%的柠檬酸失重率分别降到0.44%和0.37%。柠檬酸和壳聚糖复合固化液可以改善CPC的抗水性能, 柠檬酸含量达到20%以上时抗水性能比较显著, 几乎没有掉渣的现象发生。Yokoyama等^{[ 16]}实验结果显示柠檬酸含量为45%时能够显著改善骨水泥的抗水性能, 体内实验也显示出良好的生物相容性。

图4

Fig. 4

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	图4 固化液柠檬酸含量对抗水性能的影响Fig. 4 Effect of citric acid concentration on washout

本研究中固化液体系中除了柠檬酸外, 还加入了天然多糖壳聚糖。普遍认为壳聚糖的作用机理在于它能够与混合物中溶解的钙离子形成不溶于水的水凝胶^{[ 17, 18]}, 后者能够起到保护作用, 并进入材料的孔隙内部, 掩盖孔口, 有效地阻止调和物不被水侵蚀而溃散, 提高了CPCBA的抗水性能。

合理的固化时间是CPCBA 能否被临床接受的一个关键因素。磷酸钙盐开始溶解后, 骨水泥颗粒间溶液中钙、磷离子浓度不断升高, 达到过饱和状态, 成核析出细小羟基磷灰石晶体。随着水化反应的进行, 羟基磷灰石细小晶体不断长大并相互交联接触, 晶体越大, 接触点数量越多, 固化体越坚硬, 强度越高。从图5可以看出柠檬酸可以缩短CPCBA的固化时间。不含柠檬酸时固化时间为22 min, 添加40%柠檬酸后固化时间缩短到5.2 min, 添加 20% 柠檬酸后固化时间为16 min。文献报道, 适宜手术的最佳固化时间为 10 min。本研究40%柠檬酸的固化时间相对较短, 但可以通过调整柠檬酸的含量和固液比来调整固化时间到可以接受的范围。由此可见, 添加柠檬酸可以使得实际手术操作时, 减少手术的时间,并且固化时间可以通过柠檬酸的含量以及固液比的比例来进行调节。传统的CPC骨水泥在添加了抗水剂后往往导致固化延迟, 无法满足临床需求。本研究的固化体系中由于柠檬酸的存在, 可有效缩短固化时间。Gbureck等^{[ 19]}认为柠檬酸在CPCBA调和初期可作为触变剂, 柠檬酸加入到CPCBA浆体中能够影响和降低骨水泥粒子之间的联系, 尤其是离子之间的静电吸引力, 并最终影响到骨水泥的物理和化学性质, 尤其是提高流变性, 使得粉末颗粒之间相互接触更容易, 从而减少固化时间。

图5

Fig. 5

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	图5 柠檬酸含量对CPCBA固化时间的影响Fig. 5 Effect of citric acid concentration on setting time of CPCBA

利用XRD对采用不同固化液组成的CPCBA固化体的组成进行了初步的分析。图6 为采用不同柠檬酸含量的固化液的磷酸钙骨水泥固化体的XRD图谱, 均具有明显的羟基磷灰石特征峰。这表明水化反应已进行, 并生成了水化产物羟基磷灰石。四个产物的固化体没有明显区别, 最终产物里都只有很少量的CaHPO₄, 表明该体系DCPA和TECP基本反应完全。

图6

Fig. 6

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	图6 不同柠檬酸含量CPCBA的XRD分析Fig. 6 XRD patterns of CPCBA with different citric acid concentration

图7为CPCBA和40%柠檬酸固化液调和后的状态, 调和后骨水泥类似于口香糖状, 有较强的粘性。本实验进一步考察其对猪骨的粘结强度。从图8的粘结强度可以看出, 骨水泥的粘结强度随着柠檬酸含量的提高而增强, 不含柠檬酸粘结强度为24.5 N/cm², 加入10%、20%和40%柠檬酸粘结强度分别达到35.7 N/cm²、59.9 N/cm²和72 N/cm²。

图7

Fig. 7

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	图7 口香糖状粘性骨水泥Fig. 7 Gum-like adhesive bone cement

图8

Fig. 8

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	图8 不同柠檬酸含量的CPCBA粘结强度Fig. 8 Cohesion strength of CPCBA with different citric acid concentration

含壳聚糖和柠檬酸的固化液可以提高磷酸钙骨水泥的力学强度, 壳聚糖与金属离子有螯合作用(图9)^{[ 20]}, 固化液与CPCBA调和后涂抹在猪骨上, 壳聚糖与猪骨中的钙离子螯合作用, 增加了界面的粘结强度。同时, 随着柠檬酸含量的增加粘结强度提高, 其原因可能是柠檬酸促进壳聚糖的螯合强度。

图9

Fig. 9

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	图9 壳聚糖与钙离子螯合示意图Fig. 9 Schematic illustration of Ca2+ complex with CS

从前面的结果可以看出, 固化液含40%柠檬酸固化速度快, 抗水性好, 粘结强度高。选取该柠檬酸浓度下固化的骨水泥固化体进行细胞培养实验,并通过扫描电镜观察成骨细胞在材料表面的粘附。结果(图10)显示, MC3T3-E1成骨细胞接种于含40%柠檬酸骨水泥表面12 h 后, 细胞在材料表面已完全伸展并在材料表面粘附良好, 表明, 成骨细胞在该体系骨水泥材料表面的粘附性能良好。

图10

Fig. 10

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	图10 成骨细胞(MC3T3-E1)接种于含40%柠檬酸骨水泥表面12 h后的表面形貌Fig. 10 Schematic illustration of Ca2+ complex with CS