三乙酰丙酮铁、十六烷基二醇、油酸、油胺、苄醚、氯化铁、氯化亚铁、三甘醇、聚乙烯醇(PVA)(以上药品均为分析纯, 购自Sigma-Aldrich), 硬脂酸、氨水(分析纯, 购自成都科龙化工), 羟基磷灰石(HA)气流粉(四川大学生物材料中心提供)。

采用高温热分解法^{[ 18]}制备疏水性的Fe₃O₄磁性纳米颗粒: 2 mmol三乙酰丙酮铁、10 mmol十六烷基二醇、6 mmol油酸、6 mmol油胺与20 mL苄醚在氮气保护下搅拌加热至200 ℃保温2 h, 继续加热回流1 h, 冷却至室温后, 将所得的黑色沉淀经分离、洗涤、干燥后即得到表面被油酸包裹的疏水性磁性纳米颗粒, 记为SPIO-h。

采用共沉淀法^{[ 19]}制备亲水性的Fe₃O₄磁性纳米颗粒: 5 mmol FeCl₂、9 mmol FeCl₃溶于60 mL超纯水中, 氮气保护下搅拌加热至50℃, 缓慢加入15 mL氨水, 继续搅拌加热至80℃反应1 h, 冷却至室温后, 将所得的褐色沉淀经分离、洗涤、干燥后即得到表面带羟基的亲水性磁性纳米颗粒, 记为SPIO-c。

将羟基磷灰石(HA)气流粉在800℃下预烧8 h, 按照每100 g HA粉体加入70 mL浓度为5%的聚乙烯醇水溶液和1 g三甘醇的比例加入粘结剂, 同时按照所需复合Fe₃O₄的量加入相应的SPIO。经充分研磨混匀后, 真空干燥24 h, 取出继续研磨并过筛(~150 μm)后得到均匀混合的粉体。

将1.3节制得的混合粉体与硬脂酸造孔剂按1: 1的质量比进行混合, 搅拌均匀后压制成型, 压力为4 MPa, 保压时间为20 s。在真空烧结炉中, 将压制成型的样品经低温煅烧(300℃, 0.5 h)除去粘接剂, 并使致孔剂燃烧挥发从而在基体中残留大孔, 再升温至1100℃煅烧2 h, 随炉冷却后得到多孔的复合陶瓷, 记为MHA。未复合SPIO的纯羟基磷灰陶瓷记为HA。将HA浸泡在SPIO胶体溶液中通过吸附法制备出另一种磁性复合陶瓷^{[ 16]}, 记为MHA0。HA和MHA0均作为对照样品。通过改变Fe₃O₄磁性纳米颗粒的种类和复合量制备了一系列磁性磷酸钙复合生物陶瓷(见表1)。

表1

Table1

表1(Table1)

表1 复合支架中SPIO的掺杂类型及比例 Table1 Types of magnetic scaffolds of calcium phosphate with SPIO Name of scaffold Type of SPIO Mass ratio of SPIO/HA HA — — MHA0 SPIO-h 2:100 MHA1 SPIO-h 5:100 MHA2 SPIO-h 2:100 MHA3 SPIO-h 1:100 MHA4 SPIO-c 10:100 MHA5 SPIO-c 5:100 MHA6 SPIO-c 2:100

表1 复合支架中SPIO的掺杂类型及比例 Table1 Types of magnetic scaffolds of calcium phosphate with SPIO

采用HitachiSU-70 型热场发射扫描电子显微镜(SEM)观察样品的形貌, 并用仪器自带的能谱仪(EDS)分析样品表面的化学组成、DX-1000型X射线衍射仪分析样品的物相组成、振动样品磁强计(VSM)(BHV-525, 日本理研电子公司)测试样品的饱和磁化强度、排水法测定材料的孔隙率。

材料在水中的稳定性评价: 将材料浸泡在37℃的水中, 用原子吸收光谱仪(AAS, Perkin Elmer AAnalyst800)检测各时间点的浸提液中的Fe元素含量。

将Ros17/2.8细胞按1×10⁵cells/mL的密度接种到材料表面, 在37℃、5 vol% CO₂条件下共培养24 h后, 经戊二醛固定, 酒精梯度脱水和临界点干燥后进行SEM检测。

为了研究掺入SPIO对复合支架形貌和结构的影响, 分别选取了SPIO掺入量最高的两种材料MHA1、MHA4以及纯HA进行SEM分析。由图1可知, MHA1、MHA4均与HA具有相似的形貌和多孔结构。其大孔相互连通, 孔径约300~700 μm, 大孔孔径可通过改变致孔剂的粒径大小进行调控。同时, 大孔孔壁上还有大量1~2 μm的微孔。这种大孔套小孔的多级连通孔结构, 非常有利于组织和血管的长入及营养物质的传输^{[ 23]}。

图1

Fig. 1

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	图1 MHA1(a,d,g)、MHA4(b,e,h)及HA(c,f,i)等三种陶瓷的SEM照片Fig. 1 SEM images of MHA1 (a, d, g), MHA4 (b, e, h) and HA (c, f, i)

EDS能谱图证实了复合材料中存在Fe、Ca和P等元素, 且其元素组成比例与理论值都十分接近。如MHA4 的EDS能谱图中(图2)所示, Fe的质量百分比为6.6%, Ca/P比为1.676, 两者均十分接近理论值(分别为6.58%和1.67)。由表2可知, 吸附法制备的MHA0的Fe含量明显高于理论值, 说明SPIO在基体中分布不均, 大量富集在支架表面, 而共混烧结法制备的各种类型的磁性支架的Fe含量和Ca/P比均与相应的理论值十分接近, 未出现SPIO在局部富集的情况, 说明SPIO被成功地复合到HA中, 且分布均匀, Fe含量与掺入量一致。

图2

Fig. 2

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	图2 MHA4的扫描电镜照片(a)和EDS能谱图(b)Fig. 2 SEM image (a) and EDS pattern (b) of MHA4

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 复合支架中Fe元素的质量分数与钙/磷比 Table 2 Fe content and Ca/P ratio of magnetic scaffolds Name of scaffold Theoretical content of Fe/% Actual content of Fe /% Theoretical Ca/P ratio Actual Ca/P ratio HA Null 0 1.67 1.679 MHA0 0.85 2.87 1.67 1.658 MHA1 2.07 2.09 1.67 1.615 MHA2 0.85 0.83 1.67 1.697 MHA3 0.43 0.51 1.67 1.673 MHA4 6.58 6.60 1.67 1.676 MHA5 3.44 3.41 1.67 1.680 MHA6 1.42 1.44 1.67 1.684

表2 复合支架中Fe元素的质量分数与钙/磷比 Table 2 Fe content and Ca/P ratio of magnetic scaffolds

孔隙率测定结果显示各种类型的MHA与HA的孔隙率十分接近, 均为67%左右。且可以通过改变粉体与造孔剂的混合比例进行调控。

为了研究SPIO的掺入对HA晶体结构的影响, 分别选取了SPIO掺入量最高的两种材料MHA1、MHA4以及烧结后的纯羟基磷灰石(HA)和未经烧结的HA粉体(HA-p)进行XRD衍射分析(如图3所示)结果显示, MHA1、MHA4和HA与HA-p相比峰形变得更尖锐, 说明烧结使前三种样品的结晶度提高。四种样品均具有相似的晶体结构, 出峰位置都与标准HA十分吻合, 说明SPIO的加入未导致第二相的形成, 也未改变HA的晶体结构。由于纳米级的Fe₃O₄的衍射峰强度太弱, 在图中无法看到Fe₃O₄纳米晶体的特征峰。

图3

Fig. 3

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	图3 MHA1、MHA4、HA及HA-p四种样品的XRD图谱Fig. 3 XRD patterns of MHA1, MHA4, HA and HA-p (HA powder before sintered)

VSM测试结果显示, 本研究中各种类型的磁性复合支架具有相似的磁性能, 图4仅给出四种样品的磁滞回线, 其中a和c分别是MHA1在真空烧结后和烧结前的磁滞回线, 曲线均过原点且几乎没有剩磁和矫顽力, 显示出典型的超顺磁特性。图4(b)是MHA1在空气中烧结后的磁滞回线, 其线型与纯HA的线型(图4(d))基本一致, 磁滞回线不过原点, 存在剩磁和矫顽力, 不具有超顺磁特性。实验结果显示, 与常规烧结相比, 真空烧结过程能够有效避免SPIO被空气氧化而发生相变, 从而保留其超顺磁特性, 使复合材料具有更好的磁响应性。

图4

Fig. 4

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	图4 三种方法(a:真空烧结、b:空气中烧结、c:未烧结)制备的MHA1和经真空烧结的HA(d)的磁滞回线Fig. 4 Magnetization curves of MHA1 after sintered in vacuum (a), MHA1 after sintered in air (b), MHA1 before sintered (c) and HA after sintered in vacuum (d)

为测试复合陶瓷在水中的稳定性, 将SPIO含量最高的两种材料(MHA1和MHA4)以及对照材料MHA0在水中分别浸泡7 d, 在各时间点(4 h、8 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d)用AAS检测浸提液中的Fe元素含量。结果显示: 吸附法制备的材料在浸泡的初期(1 d)迅速释放出少量SPIO(约占复合总量的2%), 然后趋于稳定; 而共混-烧结法制备的两种材料在每个时间点的浸提液中均未检出Fe元素, 说明SPIO被牢固复合在HA基体中, 几乎未游离到浸泡液中。吸附法制备的材料由于大部份SPIO都吸附在材料的表面, 解吸附作用会使少量SPIO更容易地从材料中游离出来; 而共混-烧结法制备的复合陶瓷, SPIO纳米颗粒在烧结之前的机械混合过程中已被充分复合到HA粉体中, 再经真空烧结过程, SPIO则被牢固地包裹在HA的晶相组织中, 很难游离出来^{[ 24]}, 因此该复合陶瓷具有更好的稳定性。

SEM照片(图5) 显示, 在SPIO复合比例相同(质量比均为5:100)的MHA1与MHA5表面, 以及纯HA表面, Ros17/2.8细胞都能够很好地黏附和生长, 与HA上的细胞相比, 在相同的培养时间内(24 h)两种磁性支架上的细胞跟材料黏附得更紧密, 铺展得更好, 数量更多, 状态更好。说明经本方法所制备出的磁性陶瓷材料具有良好的生物相容性, 且比纯HA陶瓷更有利于细胞的黏附和生长。

图5

Fig. 5

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	图5 Ros17/2.8细胞在MHA1(a, d)、MHA5(b, e)和HA(c, f)材料表面粘附生长的SEM照片Fig. 5 SEM micrographs of Ros17/2.8 cells grown on MHA1 (a, d), MHA5 (b, e) and HA (c, f)

细胞在MHA1和MHA5上的黏附生长情况没有明显差异, 说明掺入的SPIO表面的亲疏水性对细胞行为无显著影响, 这可能是因为通过共混-烧结法制得的材料中, SPIO被包裹在HA的晶相组织当中, 并不能直接与细胞接触, 因此SPIO表面的亲疏水性对复合支架的生物相容性无明显影响。